色素酸性橙Ⅱ又名金橙Ⅱ，二号橙，桔黄橙，酸性金黄Ⅱ或酸性艳橙GR，俗名金黄粉，化学名为2-萘酚偶氮对苯磺酸钠。酸性橙是一种化工染料，主要用于皮革、纺织物的染色，禁止作为食品添加剂使用。但是由于酸性橙Ⅱ具有色泽鲜艳，着色稳定，价廉等特点，一些不法商贩为了牟取暴利将其用于食品生产与加工，严重危害了消费者身体健康。据中央电视台2003年第33期《每周质量报告》报道，浙江省温州市苍南县一些卤制鸡腿、鸡翅的企业违反国家的相应标准，在食品中添加酸性橙。经过2年的整顿，非食用色素酸性橙Ⅱ的使用仍时有发生，因此，及时准确判断食品中是否存在该非食用色素，建立一套快速、准确的酸性橙Ⅱ的测定方法具有重要意义。

文献报道酸性橙Ⅱ的测定方法有纸层析法和分光光度法等，这些方法操作时间长，定量精度差。我们经过大量实验摸索，建立了高效液相色谱法测定食品中酸性橙Ⅱ的方法，本方法快速、准确，适用于食品中合成食用色素与非食用色素酸性橙Ⅱ的同时测定。

1材料与方法

1.1仪器 高效液相色谱仪：Waters515泵，Waters紫外可见波长检测器；KQ-100DB型数控超声波清洗器；离心机。

1.2试剂 酸性橙Ⅱ 美国A ldrich公司；柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄：国家标准物质中心。重蒸馏水、乙酸、甲醇（色谱纯）、聚酰胺粉（过200目筛）、乙酸铵溶液（0.02mol/L）、柠檬酸溶液、无水乙醇+氨水+水溶液。

酸性橙Ⅱ标准溶液 准确称取干燥的酸性橙标样0.1000g，蒸馏水溶解，定容至100ml，此溶液1ml含1.00mg酸性橙Ⅱ。临用时，用蒸馏水稀释至1ml含10μg的酸性橙Ⅱ标准使用液。

混合着色剂标准溶液 准确称取按其纯度折算为100%质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、酸性橙Ⅱ各.100g，置100ml容量瓶中，加pH6水到刻度，配成水溶液（1.00mg/ml），临用时，用水稀释，经0.45μm滤膜过滤，配成每毫升含各种标准物质10.0μg的混合着色剂标准使用液。

1.3方法 高效液相色谱参考条件 色谱柱：DiamonsilTM（钻石）C18μm，200mm×4.6mm色谱柱（迪马公司产品）；流动相：甲醇（A）0.02mol/L醋酸铵（B）；流速：1.0ml/min，梯度洗脱如表1所示；进样量：20μl ；柱温：室温；紫外可变波长检测器：λ=484nm。

表1 梯度洗脱



1.5试样制备及测定

1.5.1液体样品 饮料实验前，含二氧化碳的试样预先加热驱除二氧化碳；配制酒类加热驱逐乙醇，不必稀释，过0.45μm滤膜后测定。

1.5.2固体样品 糕点类、卤制品类、灌制品类、辣椒面等样品，称样5.00~10.00g，粉碎混匀，加无水乙醇+氨水+水（70+1+29）溶液20ml，振摇0.5h，过滤，洗滤渣2次，合并滤液，用水（pH=6）定容，过0.45μm滤膜测定。

1.5.3 奶制品 可称量5.00g试样，按GB5009.23-2003聚酰胺吸附法提取色素，经0.45μm滤膜过滤测定。

2结果与讨论

2.1色谱条件对测定的影响

实验表明酸性橙Ⅱ在波长484nm测定，试样中常见的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因、维生素C、乙酸、柠檬酸等（1mg/ml）在可见波长下无响应（见图1、图2），不干扰测定。

2.2流动相的选择 采用甲醇+醋酸铵体系作流动相，试剂价格便宜、易得，采用梯度洗脱可以同时测定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄。分离效果参见标准色谱图3。



图1 酸性橙Ⅱ紫外-扫描图



图2 苯甲酸、山梨酸、糖精钠、咖啡因、维生素C、乙酸、柠檬酸混合紫外-可见扫描图



图3 标准色谱图

2.3线性范围和最低检出限 对酸性橙Ⅱ在0.00~200μg/ml的范围内配制标准溶液系列9个点，每标样进3针，以标样的峰面积的平均值为纵坐标，以标样的浓度为横坐标，绘制校正曲线，并利用最小二阶乘法进行线性回归，得到在0.00~100μg/ml范围内的线性方程为：A=85339.63C+105139.37，相关系数r=0.9997，酸性橙Ⅱ的检出限为0.05μg。柠檬黄、苋菜红、胭脂红及日落黄在0.00~50μg/ml范围内的线性方程分别为：A=74329.36C+5351.26相关系数r=0.9987；A=85428.98C+125212.42，相关系数r=0.9982；A=85268.23C+112145.94，相关系数r=0.9990;A=929123.47C+152372.68，相关系数r=0.9972。

2.4精密度 将酸性橙Ⅱ试样（卤鸡爪）溶液应用本方法分别连续进样8次（n=8）。其相对标准偏差为5.91%。

2.5准确度 采用加标回收实验进行准确度分析。在饮料、酒、果冻中加入5、50、80μg/ml的酸性橙Ⅱ，回收率测定结果分别见表2~4。加标5μg/ml的平均回收率为92.52%；加标50μg/ml的平均回收率为98.59%；加标80μg/ml的平均回收率为94.09%。在卤制鸡爪中加入10、50μg/ml的酸性橙Ⅱ回收率测定结果分别见表5和表6。加标10μg/ml的平均回收率为98.04%；加标50μg/ml的平均回收率为99.64%。

表2 加标酸性橙Ⅱ（5μg/ml）试样的测定结果



表3 加标酸性橙Ⅱ（50μg/ml）试样的测定结果



表4 加标酸性橙Ⅱ（80μg/ml）试样的测定结果



表5 加标酸性橙Ⅱ（10μg/ml）试样的测定结果



表6 加标酸性橙Ⅱ（50μg/ml）试样的测定结果



3样品的测定

采用上述方法，对市售卤制品、饮料、灌肠类等55份样品进行测定，检出含酸性橙Ⅱ试样2份（卤制鸡爪），含量分别为0.0045g/kg、0.0086g/kg。